流行性乙型腦炎病毒研究進(jìn)展
作者：鄧淑珍，張海林，李金梅 作者單位：1.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000； 2.云南省地方病防治所/云南省病毒立克次體研究中心，云南 大理 671000.
【摘要】 流行性乙型腦炎病死率較高，后遺癥嚴(yán)重，在亞洲地區(qū)危害較大。本文就乙腦病毒的分類、抗原特性、對細(xì)胞和動物敏感性、基因組的結(jié)構(gòu)特征、毒力基因、基因分型和疫苗等方面的研究進(jìn)展作一綜述。
【關(guān)鍵詞】 流行性乙型腦炎病毒；生物學(xué)特性；分子特征；疫苗
流行性乙型腦炎（簡稱乙腦）國際上稱為日本腦炎（Japanese encephalitis）。本病是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus）經(jīng)蚊蟲媒介叮咬傳播而引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性傳染病，也是一種人獸共患的自然疫源性疾病。臨床上以高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激征為特征。病死率較高，而且后遺癥嚴(yán)重。本病對人類健康危害較大，現(xiàn)就乙腦的病原學(xué)研究進(jìn)展綜述如下。
1 乙腦病毒分類及抗原特性
乙腦病毒在分類上屬于黃病毒科（F1aviviridae）黃病毒屬（F1avivirus）成員。在黃病毒屬中按抗原組劃分，乙腦病毒抗原組包括乙腦、西尼羅和圣路易腦炎病毒。黃病毒成員之間存在著不同程度的血清學(xué)抗體交叉反應(yīng)，而抗原組內(nèi)不同病毒之間交叉反應(yīng)更為嚴(yán)重，因此在血清學(xué)檢測和判定時要充分考慮相關(guān)病毒交叉的可能［1,2］。
2 乙腦病毒對細(xì)胞和動物敏感性
乙腦病毒能在BHK21、Vero、LLC-MK、C6/36等傳代細(xì)胞或猴腎、地鼠腎、雞胚纖維母細(xì)胞和豬腎等原代細(xì)胞中增殖，并產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。細(xì)胞感染病毒后第3～5d開始出現(xiàn)CPE，病變的特點是單層細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落及破裂，在C6/36細(xì)胞上可出現(xiàn)細(xì)胞融合形成空泡。C6/36細(xì)胞是乙腦病毒最為敏感的細(xì)胞，已廣泛應(yīng)用于乙腦病毒的分離和有關(guān)研究中。乙腦病毒能在BHK21、LLC-MK2和Vero等細(xì)胞上產(chǎn)生蝕斑。乙腦病毒腦內(nèi)接種乳小白鼠較為敏感，乳鼠可出現(xiàn)以馳緩性麻痹為主的腦炎癥狀而死亡。潛伏期3～4d。主要癥狀是行動遲緩、離群、聳毛、尾強(qiáng)直、抽搐、四肢麻痹，最終死亡。該病毒也能引起幼年小白鼠（8～10g）或成年鼠發(fā)病死亡。
3 乙腦病毒基因組的結(jié)構(gòu)特征
乙腦病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約11kb，乙腦病毒各地代表株的全核苷酸序列均有發(fā)表。乙腦病毒的基因結(jié)構(gòu)為5’端有95個核苷酸的非編碼區(qū)接著一段10 296個核苷酸的編碼區(qū)，隨后是585個核苷酸的3’ 端的非編碼區(qū)。乙腦病毒的基因組只有一個開放讀碼框，其編碼是由3個432個氨基酸組成的多聚蛋白前體，該多聚蛋白前體在宿主細(xì)胞內(nèi)，在病毒自身編碼的蛋白酶（NS3）及胞內(nèi)其它酶類作用下，形成3個結(jié)構(gòu)蛋白（C，PrM和E）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5），基因順序為：5’cap-NCR-C-PrM-M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’NCR（cap：帽狀結(jié)構(gòu)，NCR：非編碼區(qū)，C：核衣殼蛋白，PrM：前膜蛋白，M：膜蛋白，E：包膜糖蛋白；NS：非結(jié)構(gòu)蛋白）［3,4］。PrM、E和NS1糖基化，均有免疫保護(hù)作用。prM蛋白是未成熟病毒體的一部分，在病毒感染后期，它可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，E蛋白基因大小為1 500 bp，編碼500個氨基酸殘基，囊膜糖蛋白E是主要的毒力抗原，E蛋白上有特異性抗體的中和表位，可誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生中和抗體。NS1是糖基化蛋白，為乙腦病毒的保護(hù)性抗原，而NS1蛋白為可溶性補(bǔ)體固定原。
4 乙腦病毒毒力基因
已發(fā)現(xiàn)影響乙腦病毒毒力的相關(guān)因素很多, 如病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的能力、病毒與細(xì)胞融合的速率、病毒RNA 合成酶的合成速率等,都會不同程度地影響該病毒的毒力。通過對減毒株和野毒株的比較研究發(fā)現(xiàn)影響乙腦病毒毒力的7個共有氨基酸突變位點，即E138（Glu-Lys）、E176(Ile-Val)、E315(Ala-Val)、E439(Lys-Arg)、Ns2-63（Glu-Asp）、NS3-105((Ala-Gly)、NS4B(Ile- Val),其中有4個位點集中在E基因區(qū)，其余變異位點分布在非結(jié)構(gòu)基因，表明影響毒力的因素不僅限于 E基因。其它一些突變位點屬于非共同的氨基酸突變位點，分別分布在結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因部位，但這些非共同的氨基酸突變位點是否對乙腦病毒毒力有影響尚需進(jìn)一步研究［5,6］。
Sumiyoshi等的研究也證明，E蛋白在乙腦病毒毒力中占有重要位置，E基因的單點突變即可使乙腦病毒喪失其神經(jīng)毒力/侵襲力［7］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SA14-14-2減毒株與其母株SA14野毒株的E區(qū)比較共有8個氨基酸殘基差異，具體位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439位，是毒力減弱的關(guān)鍵氨基酸殘基位點［6,8］。還發(fā)現(xiàn)AT31和AT222E蛋白上E138和E176位點氨基酸變化可能改變了E蛋白對細(xì)胞受體的吸附性，或者引起該病毒對其他細(xì)胞不可穿透，導(dǎo)致病毒毒力減弱，E138和E176一起對乙腦病毒強(qiáng)毒株在連續(xù)性傳代過程中毒力減弱起了關(guān)鍵作用，這2個位點上的氨基酸是決定乙腦病毒病原性的關(guān)鍵氨基酸，與乙腦病毒神經(jīng)毒力密切相關(guān)［9］。因此，利用E蛋白這一分子生物學(xué)特性，以開發(fā)更有效，更廉價的乙腦疫苗［10,11］。
5 乙腦病毒基因分型
首先由Takegami（1982）將乙腦病毒分為 3 個血清型（Ja Gar、 Nakayama 和 Mie型）。進(jìn)一步的研究，依據(jù)交叉中和試驗，RNA 寡核苷酸指紋圖譜、基因序列以及單克隆抗體的交叉反應(yīng)性,可將乙腦病毒分為5 抗原組，即Nakayama2RFVL(分離自日本東京)、Kamiyama(分離自日本福岡)、691004(分離自斯里蘭卡)、Beijing21(分離自中國) 和 Muar (分離自新加坡)。近幾年，普遍采用Chen等建立的基因分型法對乙腦病毒進(jìn)行分型［12,13］。根據(jù)核酸序列的同源性，Chen等將乙腦病毒基因分型的cut-off值定為12%的差異度，從而得到進(jìn)化關(guān)系上較為明顯的4個型：泰國北部及柬埔寨地區(qū)分離的毒株屬于基因Ⅰ型；來自泰國南部、馬來西亞、印度尼西亞的毒株形成基因Ⅱ型；來自日本、中國等地區(qū)的毒株屬于基因Ⅲ型；部分印度尼西亞的毒株獨自形成了基因IV型［14］。有研究發(fā)現(xiàn)同一基因型的毒株在地域上有更為緊密的聯(lián)系，即有明顯的地域性，在同一地區(qū)分離的毒株即使年代相差很遠(yuǎn)也屬于同一基因型。但是近十多年來，乙腦病毒基因型的分布地區(qū)有了新的變化；中國大陸、韓國和日本已經(jīng)報道發(fā)現(xiàn)基因Ⅰ型乙腦病毒［15,16］；1995年澳大利亞首次出現(xiàn)乙腦病例，其后分離的毒株分別屬于基因Ⅰ型和Ⅱ型［17］。近幾年，我國對不同來源的乙腦病毒進(jìn)行了基因分型［16,18～21］，發(fā)現(xiàn)分離自我國的乙腦病毒絕大多數(shù)是Ⅲ型，并廣泛分布于各地乙腦疫區(qū)。也證實我國有1型乙腦病毒的分布，最早分離到1型病毒的時間為1977年，認(rèn)為1型病毒可能是輸入的。最近分離到的乙腦病毒大多為Ⅲ型，還從上海、遼寧和云南分離到1型病毒。臺灣對不同來源的47株病毒進(jìn)行研究，可分為1、2和3群（型）［22］。乙腦病毒4個型之間具有較強(qiáng)的交叉保護(hù)作用，在血清學(xué)和免疫學(xué)試驗中也有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，用血清學(xué)試驗難以區(qū)分乙腦病毒的型別。
6 乙腦實驗診斷技術(shù)
乙腦病毒抗體檢測方法較多，如血凝抑制、補(bǔ)體結(jié)合、中和、間接血凝抑制、乳膠凝集、酶聯(lián)免疫和免疫熒光試驗等。其中酶聯(lián)免疫試驗檢查IgM和IgG抗體是目前用于病人診斷較為常見的方法，由于乙腦病毒與其它黃病毒有交叉反應(yīng)，近年來由于采用乙腦病毒特異性蛋白制備抗原［23］，該法的特異性和敏感性均有較大提高。其它方法主要用于流行病學(xué)調(diào)查和實驗研究中。病毒分離仍然使用細(xì)胞或小鼠法，由于分子生物學(xué)方法的發(fā)展和逐漸普及，病毒檢測更為簡便和快速，培養(yǎng)物經(jīng)過血清學(xué)方法初步判定后，用RT-PCR法檢測乙腦病毒核酸即可作出準(zhǔn)確鑒定，通過序列測定分析可確定分離株的分子遺傳特征。實時熒光PCR和基因芯片技術(shù)的發(fā)展，為乙腦的診斷提供了更好的方法［24］。
7 乙腦疫苗及其應(yīng)用
控制乙腦流行的方法主要是滅蚊和疫苗接種。在蚊蟲控制措施難以全面落實的情況下，疫苗接種成為控制乙腦流行最為有效的方法。目前，國內(nèi)外應(yīng)用的乙腦疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗兩種。滅活疫苗主要是鼠腦純化滅活疫苗和地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗。鼠腦純化滅活疫苗是從感染鼠腦培養(yǎng)制備的，由日本研制生產(chǎn)并得到國際廣泛認(rèn)可和使用的疫苗；地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗為我國生產(chǎn)，病毒經(jīng)原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)制備的疫苗，1998年開始生產(chǎn)使用，隨后在全國大面積使用。近幾年，Vero細(xì)胞純化滅活疫苗已在研究生產(chǎn)，該疫苗為新一代的乙腦滅活疫苗，有較好的發(fā)展前景。減毒活疫苗主要是我國自主研制的乙腦SA14-14-2株，為目前唯一獲得認(rèn)可和推廣使用的乙腦活疫苗，自1989年獲得新藥證書以來，該疫苗產(chǎn)量不斷增多，并在全國廣泛使用已達(dá)3億多人份，該疫苗具有接種針次少、副反應(yīng)小、免疫原性高、免疫效果好等優(yōu)點而在國內(nèi)得到廣泛應(yīng)用并出口到韓國、尼泊爾和印度等亞洲國家使用［25,26］。然而，由于接種減毒活疫苗后，可在人體內(nèi)產(chǎn)生感染過程和出現(xiàn)病毒血癥，該疫苗病毒能否通過媒介蚊蟲叮吸接種疫苗者的血液將病毒傳播給健康人而引起疾病，尤其是SA14-14-2病毒通過蚊蟲增殖后其弱毒特性和基因型特征能否發(fā)生回復(fù)突變，毒力增強(qiáng)而發(fā)生病毒生態(tài)學(xué)改變等，仍然是世界衛(wèi)生組織及專家們最擔(dān)心和關(guān)注的問題。最近，我國學(xué)者對現(xiàn)行使用的減毒活疫苗SA14-14-2病毒進(jìn)行了感染蚊蟲實驗及安全性評價。研究認(rèn)為，作為乙腦主要傳播媒介的三帶喙庫蚊和致倦庫蚊對SA14-14-2疫苗株的經(jīng)口感染和病毒在蚊體內(nèi)的復(fù)制嚴(yán)重受限［27］，但經(jīng)胸腔接種SA14-14-2株后，病毒能在三帶喙庫蚊和致倦庫蚊體內(nèi)增殖［28,29］。而對照實驗表明，這兩種庫蚊無論經(jīng)口或胸腔接種野毒株均能在蚊體內(nèi)增殖，且蚊體內(nèi)病毒滴度較高。說明減毒疫苗病毒已不具有在蚊蟲中腸細(xì)胞增殖的特性，即使蚊蟲按自然途徑（經(jīng)口）叮吸接種過乙腦減毒活疫苗SA14-14-2病毒的人或動物血液后，疫苗病毒也不會在蚊體內(nèi)感染增殖，更不會引起疫苗病毒的傳播［27～29］，并以此推論媒介庫蚊叮吸被該活疫苗免疫的宿主動物和人后，不會引起感染和傳播。雖然經(jīng)非自然途徑（胸腔接種），該疫苗病毒可在蚊體內(nèi)感染復(fù)制，但經(jīng)蚊體內(nèi)增殖后的疫苗病毒的弱毒特性未發(fā)生改變，并通過對該病毒E區(qū)的比較分析，獲得了SA14-14-2減毒株弱毒特性保持穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)，完全符合現(xiàn)行國家藥典的規(guī)定［30］。該研究首次證實我國自行開發(fā)的乙腦減毒活疫苗的應(yīng)用不會引起該病毒的生態(tài)學(xué)改變，廣泛使用該疫苗是安全的，對該疫苗安全性的證實將促進(jìn)該疫苗在全世界的推廣和使用。
基因工程疫苗是乙腦疫苗發(fā)展的方向，國內(nèi)外學(xué)者在嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白質(zhì)疫苗和亞病毒顆粒疫苗方面取得了一些進(jìn)展。如用乙腦SA14-14-2病毒的PrM和包膜E蛋白基因代替17D黃熱病毒cDNA的相應(yīng)序列，構(gòu)建了嵌合的減毒乙腦疫苗，免疫鼠和猴子具有安全性、免疫原性和保護(hù)作用［30］。用表達(dá)的乙腦病毒E蛋白（或含Prm和E 基因；Prm、E、NS1和NS2基因）的重組痘苗病毒免疫小鼠能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體及抗乙腦病毒攻擊［32］。DNA疫苗研究用構(gòu)建編碼乙腦病毒E蛋白的DNA質(zhì)粒接種小鼠，對攻擊感染有一定保護(hù)作用，但免疫鼠中未能檢出乙腦病毒抗體，而產(chǎn)生了低水平的乙腦病毒特異性T細(xì)胞增殖，認(rèn)為保護(hù)作用可能主要與細(xì)胞免疫有關(guān)［33,34］。另外的研究用構(gòu)建的含乙腦病毒Prm和E基因的質(zhì)粒免疫鼠，能產(chǎn)生較高水平的特異性中和抗體，并對乙腦病毒攻擊感染產(chǎn)生完全的保護(hù)，免疫豬能產(chǎn)生記憶B細(xì)胞和持續(xù)產(chǎn)生中和抗體，認(rèn)為該疫苗可作為第二代乙腦候選疫苗［32,35～37］。有的學(xué)者用乙腦病毒NS1基因的質(zhì)粒免疫小鼠，對乙腦病毒攻擊產(chǎn)生保護(hù)性免疫［38］。用乙腦病毒Prm和E蛋白組成的細(xì)胞外顆粒（EPs）免疫小鼠能產(chǎn)生特異的中和抗體和T淋巴細(xì)胞［39］。雖然基因工程疫苗有良好的發(fā)展前景，但在臨床使用前尚有很多問題需要解決。
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